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    登革热

    【概述】

登革热(dengue fever)是由1~4型登革病毒(Dengue virus,Dv;DEN)引起、经伊蚊传播的急性传染病,亚洲、大洋洲、美洲和非洲均有本病发生,是热带、亚热带地区的一个非常严重的公共卫生问题。临床特征为起病急骤,高热,全身肌肉、骨骼及关节痛,极度疲乏,部分患者可有皮疹、出血倾向和淋巴结肿大。
    本病于1779年在埃及开罗、印度尼西亚雅加达及美国费城发现,并据症状命名为关节热和骨折热。1869年由英国伦敦皇家内科学会命名为登革热。
    20世纪,登革热在世界各地发生过多次大流行,病例数百万计。1979年以来,登革热在全世界范围内迅速蔓延,今天发生登革热的国家数量已经扩大到50多个。
    目前,世界每年发生登革病毒感染患者超过1亿人,并有50万人发展成为登革出血热或登革休克综合征,造成大约25 000人死亡。目前登革热的主要发病区仍在亚洲和非洲,例如印度、巴基斯坦、斯里兰卡和中国,中美洲加勒比海以及南美洲的古巴、巴西、委内瑞拉、圭亚那等国。究其原因,德国汉堡热带医学专家赫伯特?施米茨教授认为,全球化速度的加快、世界各地之间人员往来的增多、城市化和人口的飞速增长等都对登革热的迅速蔓延起推波助澜的作用。
    我国于1978年在广东流行,并分离出第Ⅳ型登革热病毒。此后,于1979、1980、1985年小流行中分离出Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒。《中华人民共和国传染病防治法》规定将其定为乙类传染病。20世纪90年代以来,该病在中国广东、福建时有发生,多为小规模流行或散发。1999年和2004年因输人性病例导致福建和浙江等地发生暴发流行,其他省区近年来也常有输入性病例的发生。

    【病因与发病机制】

病原学:
    登革热病毒属B组虫媒病毒,现在归入披盖病毒科(togaviridae)黄热病毒属(flavivirus)。病毒颗粒呈哑铃状(700×(20~40)nm)、棒状或球形(直径为20~50nm)。髓核为单股线状核糖核酸(RNA)。病毒颗粒与乙型脑炎病毒相似,最外层为两种糖蛋白组成的包膜,包膜含有型和群特异性抗原,用中和试验可鉴定其型别。登革病毒可分为4个血清型,与其他B组虫媒病毒如乙型脑炎病毒可交叉免疫反应。
    登革病毒在l~3d龄新生小白鼠脑、猴肾细胞株、伊蚊胸肌及C6/36细胞株内生长良好,并产生恒定的细胞病变。但接种猴子、猩猩和其他实验动物,不产生症状。
    登革病毒对寒冷的抵抗力强,在人血清中贮存于普通冰箱可保持传染性数周,-70℃可存活8年之久;但不耐热。50℃、30min或100℃、2min皆能使之灭活;不耐酸、不耐醚。用乙醚、紫外线或0.05%甲醛可以灭活。

(一)登革病毒基因组结构
    登革病毒基因组为单股、正链RNA,长约11 kb,病毒RNA具感染性,其基因组RNA的5′端有Ⅰ型帽子结构。在3′末端没有发现多聚A结构,但有一个十分保守的核苷酸序列,是形成3′末端二级结构的一部分。可能对RNA的复制和核壳化是非常重要的。
    目前登革病毒1~4型的基因序列均已清楚,cDNA序列分析表明,病毒RNA只含有一个长的开放读码框架,约96%的核苷酸在此框架内,登革病毒基因组分为两个区段:5′端1/4编码病毒3个结构蛋白,3′端3/4编码7个非结构蛋白。基因组的5′端和3′端均有一段非编码区。整个基因的编码顺序为:5′-Ⅰ型帽子结构非编码序列-AUG-C蛋白(核衣壳蛋白)基因-M蛋白(膜蛋白)基因-E蛋白基因(包膜蛋白)-NS1基因-NS2a基因-NS2b基因-NS3基因-NS4a基因-NS4b基因-NS5基因-非编码序列。

(二)毒粒蛋白的结构与功能
    1.E蛋白 全长494个氨基酸,相对分子质量近60 000,是毒粒的主要包膜蛋白,它有中和抗原表位,有型特异表位,又有DEN种及黄病毒属特异性表位。
    根据E基因序列分析及带二硫键的不同抗原决定簇的结构特性,国外学者提出了一种E蛋白结构模型。这个模型主要由三个不重叠的抗原区A、B和C组成。A、B两区含有不连续的抗原决定簇,它的完整性有赖于通过二硫键形成的空间结构,而变异性高的C区则没有二硫键,此区的抗原决定簇不能被还原作用、羧甲基化作用、SDS变性作用而灭活。以上三个区占整个E蛋白的绝大部分,在包膜表面形成突起,是DEN参与分子识别的重要结构,在DEN的致病和免疫中起着至关重要的作用。
    E蛋白在毒粒与宿主细胞之间相互作用的过程中发挥着重要的功能。E蛋白可能是某些宿主细胞表面受体的配体,E蛋白与受体的结合,可能促进DEN对细胞的感染。它可能还是一种膜融合蛋白,当毒粒与宿主细胞接触时,E蛋白可能在细胞表面诱导毒粒包膜与细胞膜的融合,从而促进毒粒进入细胞引起感染。
    E蛋白的A、B两区存在有诱导中和抗体产生以及和血凝作用有关的抗体表位,它能诱导宿主产生保护性的中和抗体,又能诱导产生血凝抑制抗体。还可能会引起抗体依赖的增强感染作用(ADE)。而ADE可导致登革出血热(DHF)和登革休克综合症(DSS)。

2.C蛋白和PrM及M蛋白 C蛋白是核衣壳蛋白,富含有赖氨酸和精氨酸,相对分子质量约13 500,病毒基因组的翻译起始于衣壳蛋白。在C蛋白之后的PrM蛋白,是一种糖蛋白,为M蛋白的前体,在病毒成熟过程中PrM糖蛋白经特异性酶切后形成一个相对分子质量约8 000的M蛋白,它能导致病毒感染增强,并形成毒粒的表面结构。

3.非结构蛋白(NS)1~5 NS1、NS2、NS3、NS4和NS5等非结构蛋白在病毒复制过程中的作用,目前尚不十分清楚。但已有资料表明,NS1和NS3在病毒免疫反应中起重要作用。
    NS1是一种糖蛋白,相对分子质量为48 000,较多学者报道用NS1免疫小鼠后,能诱导小鼠产生针对同型DEN致死性的攻击具有保护作用的抗体。
    NS3是一种相对分子质量为70 000左右的亲水蛋白,其N端区域与胰蛋白样丝氨酸蛋白酶有同肽段,而C端序列参加核酸复制的蛋白酶序列相似,因此可能同时具有两种酶活性。NS3与NS1一样既具有反应原性,又具有免疫原性,用NS3免疫小鼠后同样可诱导产生具有保护作用的抗体。

登革病毒通过伊蚊叮咬进入人体,在网状内皮系统增殖至一定数量后,即进入血循环(第1次病毒血症),然后再定位于网状内皮系统和淋巴组织之中,在外周血液中的大单核细胞、组织中的与噬细胞、组织细胞和肝脏的Kupffer细胞内再复制至一定程度,释出于血流中,引起第2次病毒血症。体液中的抗登革病毒抗体,可促进病毒在上述细胞内复制。并可与登革病毒形成免疫复合物,激活补体系统,导致血管通透性增加,同时抑制骨髓中的白细胞和血小板系统,导致白细胞、血小板减少和出血倾向。

(一)登革出血热的发病机制
    DHF或DSS多发生在第2次感染异型DEN的患者或母亲杭DEN抗体阳性的婴儿中,病死率高。因此其发病机制一直是国内外研究的重要课题,但至今还没有完全阐明。概括许多学者研究的结果提出了以下几种发病机制。
    1.依赖抗体增强感染(ADE)作用 ADE学说认为:当感染某一型DEN后产生的抗体能与所有四型的DEN起交叉反应。这些异型抗体或亚中和浓度的抗体,虽然能与病毒颗粒相结合,却不能起中和作用,而是形成病毒抗体复合物,并通过IgG的Fc受体(FcR)结合到单核细胞系表面,随着吞噬作用病毒进入细胞内,并在细胞内繁殖。引起单核细胞系感染。被DEN感染的单核巨噬细胞系又被机体的免疫清除反应和一些内源性刺激物所激活,释放出裂解补体3(C3)的酶、血管通透因子和凝血致活酶,进而导致弥散性血管内凝血(DIC)、出血、休克等一系列病理过程。现已阐明,DEN颗粒和相应的IgG抗体形成的病毒抗体复合物主要是通过IgG Fc段吸附到细胞上导致感染增强作用。

2.细胞免疫作用 近年来人们发现细胞免疫在DHF/DSS形成中也起重要的作用。①CD4+、CD8细胞:这类细胞在病毒感染中辅助B细胞产生抗体,人们推测在DEN感染所致的DHF/DSS发病机制中,宿主细胞的交叉免疫反应可能与之有关。Kurane等研究表明,CD4+、CD8特异性T细胞具有辅助活性,在增殖反应中能产生IFN-γ,而后者可促进单核细胞FcR的表达,从而增强感染。②CD4、CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL):国外学者报道用DEN4型免疫人的外周血单个核细胞(PBMC),在体外再用DEN4型刺激,可产生特异性且具有血清型交叉反应性的CD4、CD8+表型的CTL克隆株,它们能溶解DEN感染的细胞和接触过所有四型DEN抗原的细胞。另有报道表明在DHF、DSS患者中CD8+T细胞的活化程度明显高于登革热患者,所以具有型交叉反应的CD8+毒性T细胞可能是DEN第二次感染期间导致免疫病理的主要介导物之一。

3.细胞因子的作用 近年来人们也发现在DHF发病机制研究中,一些DEN诱导的细胞因子也起一定的作用。Krishnamurti等研究表明用DEN感染人的单核细胞后,能使尿激酶的抑制物(PA1~2)浓度升高,从而影响纤维蛋白的溶解,促进纤维蛋白沉积,导致出血。另有学者也报道DEN感染的小鼠其淋巴细胞、巨噬细胞可分别产生抑制因子SF1和3SF2,从而抑制一系列免疫反应;DEN感染的小鼠脾T细胞能产生细胞毒因子CF1和CF2,可导致免疫系统损伤,使特异和非特异免疫功能均下降。体内研究也表明感染DEN会导致各类T细胞的激活并释放细胞因子IL-2,IFN-γ、组胺,过敏素C3a、C5a等,可引起感染加重、休克、循环衰竭和出血等表现。
    上述这些机制可以解释大多数的DHF/DSS的发病机制,但对于第一次感染DEN出现的DHF/DSS患者却无法解释。总之,对于DHF/DSS的发病机制还有待进一步研究。

(二)登革出血热的病理变化
    病理变化有肝、肾、心和脑的退行性变;心内膜、心包、胸膜、胃肠黏膜、肌肉、皮肤及中枢神经系统不同程度的出血;皮疹内小血管内皮肿胀,血管周围水肿及单核细胞浸润。重症患者可有肝小叶中央坏死及淤胆,小叶性肺炎,肺小脓肿形成等。登革出血热病理变化为全身微血管损害,导致血浆蛋白渗出及出血。消化道、心内膜下、皮下、肝包膜下、肺及软组织均有渗出和出血,内脏小血管及微血管周围水肿、出血和淋巴细胞浸润。脑型患者尸检可见蛛网膜下腔及脑实质灶性出血,脑水肿及脑软化。

    【诊断要点】

     诊断要点概述

1.流行病学资料 在流行季节,来自流行区15d内的患者或在当地感染发病的患者,凡具备登革热一般症状,并符合突然起病,发热24~36h达高峰,三红征,皮疹,表浅淋巴结肿大,束臂试验阳性,白细胞和血小板减少等特点者,结合流行病学资料可作出临床诊断。首例(批)患者和新发疫区患者的确诊必须以血清学和病原学作为依据。
    2.临床表现 凡遇发热、皮疹、骨及关节剧痛和淋巴结肿大者应考虑本病;登革热患者中凡出现1个器官以上出血、有明显出血倾向,如出血点,紫斑、鼻出血、便血等,束臂试验阳性、血液浓缩、肝肿大、血小板减少(10×109/L以下),血液浓缩者可诊断为登革出血热;登革出血热患者在本病过程中或退热后,病情加重,有明显出血倾向,同时伴周围循环衰竭者等休克症状,脉压低或血压低,血细胞比容增高者,应考虑登革休克综合征。但首例患者确诊和新疫区的确定,必须结合实验室检查。

     临床表现

潜伏期5~8d。按世界卫生组织标准分为典型登革热、登革出血热和登革休克综合征3型。我国近年来所见的登革热可分为典型登革热、轻型登革热和重型登革热。

(一)典型登革热
    1.典型登革热
    (1)发热:所有患者均发热。起病急,先寒战,随之体温迅速升高,24h内可达40℃。一般持续5~7d,然后骤降至正常,热型多不规则,部分病例于第3~5d体温降至正常,1d后又再升高,称为双峰热或鞍型热。儿童病例起病较缓、热度也较低。
    (2)全身毒血症状:发热时伴全身症状,如头痛、腰痛,尤其骨、关节疼痛剧烈,似骨折样或碎骨样,严重者影响活动,但外观无红肿。消化道症状可有食欲下降、恶心、呕吐、腹痛、腹泻。脉搏早期加快,后期变缓。严重者疲乏无力呈衰竭状态。
    (3)皮疹:于病程3~6d出现,为斑丘疹或麻疹样皮疹,也有猩红热样皮疹,红色斑疹,重者变为出血性皮疹。皮疹分布于全身、四肢、躯干和头面部,多有痒感,皮疹持续5~7d。疹退后无脱屑及色素沉着。
    (4)出血:25%~50%病例有不同程度出血,如牙龈出血、鼻衄、消化道出血、咯血、血尿等。
    (5)其他:多有浅表淋巴结肿大。约1/4病例有肝脏肿大及ALT升高,个别病例可出现黄疸,束臂试验阳性。

2.轻型登革热 表现类似流行性感冒,短期发热,全身疼痛较轻,皮疹稀少或无疹,常有表浅淋巴结肿大。因症状不典型,容易误诊或漏疹。

3.重型登革热 早期具有典型登革热的所有表现,但于3~6d突然加重,剧烈头痛、呕吐、谵妄、昏迷、抽搐、大汗、血压骤降、颈强直、瞳孔散大等脑膜脑炎表现。有些病例表现为消化道大出血和出血性休克。

(二)登革出血热
    分为两型即较轻的登革出血热和较重的登革休克综合征
    1.登革出血热开始表现为典型登革热。发热、肌痛、腰痛、但骨、关节痛不显著,而出血倾向严重,如鼻出血、呕血、咯血、尿血、便血等。常有两个以上器官大量出血,出血量大于100ml。血浓缩,血细胞比容增加20%以上,血小板计数<100×109/L。有的病例出血量虽小,但出血部位位于脑、心脏、肾上腺等重要脏器而危及生命。
    2.登革休克综合征具有典型登革热的表现;在病程中或退热后,病情突然加重,有明显出血倾向伴周围循环衰竭。表现皮肤湿冷,脉快而弱,脉压差进行性缩小,血压下降甚至测不到,烦躁、昏睡、昏迷等。病情凶险,如不及时抢救,可于4~6h内死亡。

     实验室检查

(一)血象
    登革热患者的白细胞总数起病时即有减少,第4~5d降至低点(2×109/L),至出疹期尤为明显;中性粒细胞百分比也见降低,并有明显核左移现象,有异常淋巴细胞,淋巴细胞相对增高。可见中毒颗粒及核左移。1/4~3/4病例血小板减少,最低可达13×109/L。退热后1周血象恢复正常。
    登革出血热患者的白细胞总数正常或增多,后者见于严重病例及有继发感染者,一般在10×109/L以上。血小板减少,最低可达10×109/L以下。
    尿常规可有少量蛋白、红细胞、白细胞,有时有管型。部分病例脑脊液可轻度异常。

(二)血清免疫学检查
    常用者有补体结合试验、红细胞凝集抑制试验和中和试验。以血凝抑制试验的灵敏性较高,而以补体结合试验最具特异性。恢复期单份标本补体结合抗体效价达到1:32以上有诊断意义,红细胞凝集抑制试验效价超过1:1 280者有诊断意义。双份血清恢复期抗体效价比急性期高4倍以上者可以确诊。中和试验特异性高,但操作困难,中和指数超过50者为阳性。

Dv抗体的检测
    ①总抗体/IgG的检测:传统的HI、CF、NT试验需双份血清,与其他黄病毒属病毒有交叉反应.敏感性低,操作繁琐。1979年Dittmar用卫ELISA间接法检测登革病毒(Dv)的抗体,并应用阻断试验勉强可以分型。1985年陈香蕊对此法进行了改进,病毒分型得到满意解决。1991年Cardosa等建立了酶免疫斑点法(DEIA),在稀释1:1 000的血清中,该法能敏感地检出再次感染者近期感染产生的Dv抗体,特异性达97.3%,检出的抗体最高滴度为1:16000,而IFA为1:160,CF为1:64。1992年罗瑞仙等首次将该法介绍到国内。1997年周坚运用该法检测了47例标本,41例阳性,检出时间均在发病后1~7d,其中5d内检出阳性人数占总阳性人数的95.1%,有利于DF的早期诊断。1997年姚海军等建立斑点免疫金渗滤法(dot immunogold filtration assay,DIGFA),敏感性与DEIA相近,阳性一致率为96.6%,整个检测过程只需5min左右,不需特殊设备,适于在基层实验室推广应用。
    ②IgM抗体的检测:有抗体捕捉放免法,酶标抗原免疫法,血细胞吸附的免疫吸附技术(HSIST)及Lam、Innis等使用的IgM抗体捕获ELISA(MAC-ELISA),国内也有很多关于MAC-ELISA的报道。在以上各种方法中以MAC-ELISA最优。1994年王飞对此作了改进,建立了MAC-AB-ELISA,它具有更高的敏感性和特异性,仅需单份血清,最早在病程第2天或第3天即可检出Dv特异性IgM,检出滴度可高达1:3 200~1:25 600,可用于早期诊断,且与其他黄病毒属病毒和类风湿因子的阳性血清无交叉反应,可分型诊断。应当说明,MAC-ELISA检查IgM用于DF的早期诊断,受DF潜伏期仅为5~9d的限制,一部分患者发病初始时尚未开始出现IgM的应答反应,从各家报道来看,急性期(症状期)约只有半数患者可检出IgM。尽管如此,与常规的病毒分离法或检查总抗体的方法相比,仍具有一定的早期诊断意义。

(三)病毒分离
    将急性期患者血清接种于新生(1~3d龄)小白鼠脑内、猴肾细胞株或白纹伊蚊胸肌内分离病毒,第1日阳性率可达40%,以后逐渐减低,在病程第12d仍可分离出病毒。最近采用白纹伊蚊细胞株C6/36进行病毒分离,阳性率高达70%。用C6/36细胞培养第2代分离材料作为病毒红细胞凝集素进行病毒分型的红细胞凝集抑制试验,或作为补体结合抗原作补体结合试验分型,可达到快速诊断的目的。
    用于病毒分离的标本主要有患者急性期血液,尸检肝、脾、脑、血块等和媒介蚊虫三类。标本采集后立即冷冻保存,尽快送往实验室,以无菌操作将血清稀释成1:10,组织块和蚊虫标本制备成10%悬液,然后即可用以下三类方法分离病毒。

1.乳鼠脑内或脑腹内联合接种 1944年Kimura和Hotta首次用Dv感染小白鼠Swissalbino系成功。标本采取后立即脑腔接种1~3d龄乳鼠4只,每只0.02ml,放回母鼠笼内饲养,观察7~10d。如乳鼠出现弓背、震颤、行动蹒跚等发病表现,即可取出解剖收获鼠脑,以备传代和鉴定。如观察10d不见发病,可取脑盲目传代。该法需多次传代或转种细胞培养,分离阳性率低,现已极少使用。

2.细胞培养 可用脊椎动物细胞或蚊虫细胞培养。1996年Hotta和Evans首次报道登革病毒在单层恒河猴肾细胞增殖成功。20世纪60年代末Singh和Paul首次应用蚊细胞培养Dv成功,目前国内外已建立多株对Dv敏感的细胞株。脊椎动物细胞中以LLC-MK2细胞较为敏感。所有细胞株中以白纹伊蚊传代细胞C6/36细胞最为敏感,其对4个型的Dv均能产生CPE,繁殖滴度可达5.0~7.5logSMLD50。目前C6/36细胞微量培养法用得最为广泛,阳性率普遍达44.9%~71.8%。1997年江振友等对常规微量细胞培养法做了改进,建立了一种不需预先制备细胞单层的速成甲基纤维素半微量空斑技术,操作简便、快速、重复性好,空斑平均水平高于常规法。但应注意,有些毒株不产生细胞病变,这样的病例就不能通过细胞接种的方法检出。

3.蚊虫培养 1974年Rosen和Gubler首次证明Dv胸内接种白纹伊蚊的可行性。1976年Gubler用该法从69例急性期患者血清分离出45株Dv,阳性率为65%。白纹伊蚊雌雄株对Dv有相同敏感性。用蚊虫做病毒分离的优点是即使血清中含有1:2~1:300病毒抗体,也能分离出病毒,而用乳鼠或细胞培养分离患者血清中的病毒,要将血清做适当的连续稀释,如不稀释或稀释倍数低,分离病毒可能失败;但蚊虫的外潜伏期较长,不适宜快速分离病毒,且应特别注意安全,防止感染蚊逃逸。1981年Rosen用巨蚊(Toxorhyn chites)接种Dv获成功,因巨蚊无吸血习性,实验更安全。
    大量实验证明,蚊虫分离病毒比细胞培养和乳鼠接种更敏感
    病毒分离是确诊流行病病原最可靠的方法,但费时、繁琐,至少需1周时间才能出结果,达不到早期、快速诊断的目的。

Dv及其抗原的检测
    Dv分离培养后的鉴定分型,经典方法有血凝抑制试验(HI)、补体结合试验(CF)和中和试验(NT)。以上方法不同程度地存在着敏感性低、特异性差、操作繁琐、耗时等不足,尤其是分型困难。20世纪70年代建立了一批新技术用于Dv抗原的检测,使以上缺点有所克服,这些技术主要有免疫荧光法(IFA),酶联免疫吸附试验(ELISA),放射免疫技术(RIA),对流免疫电泳试验,SPA协同凝集试验,固相免疫电镜法,登革免疫印迹法(DBA)等。1980年以后单克隆抗体(McAb)技术用于Dv抗原的检测,使分型问题得到解决。近十多年来,在上述方法的基础上,应用了生物素—亲和素(avidin-biotin,AB)等放大系统、硝酸纤维滤膜(NC)等载体,使方法更敏感、特异、安全、简便。
    目前检测Dv抗原的方法大多仍离不开细胞或蚊虫培养,如能省去病毒分离培养这一步,直接从血液标本中检出Dv抗原,无疑可做到早期诊断。Monath用McAb-RIA检测病毒血症患者血清中的抗原,检出率达43%~47%,1995年Malergue等建立荧光ELISA(F-ELISA),直接检测患者血液中的Dv抗原,敏感性达90%,特异性达99%,与细胞培养法的一致率达98%。1995年田小东等建立了胶乳凝集法,他用多克隆抗体(PcAb)致敏的三元共聚重氮聚苯乙烯胶乳试剂直接定性检测患者血清中Dv抗原,共检测DF患者急性期血清标本57份,在病程第1~14d均具较高的检出率,检出率为77.19%,与PCR和病毒分离法的符合率分别为82.46%和71.93%,其缺点是不能分型,如能运用McAb,估计可以分型,尚需进一步研究。

(四)其他
    在登革出血热病例中可出现血液浓缩,出、凝血时间延长,血清天冬氨酸转氨酶升高,凝血酶原时间延长,电解质紊乱,血白蛋白降低,代谢性酸中毒等。各种凝血因子轻度降低,纤维蛋白原减少。纤维蛋白原降解物轻至中度增加。半数以上的休克病例有DIC表现。

(五)登革病毒的基因诊断
    DEN感染的诊断,过去主要依靠病毒分离和血清学检测,这此方法比较繁琐、费事,而且早期性、敏感性和特异性都较差。近年来反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、原位杂交等新技术的建立,使对DEN的诊断进入到分子生物学的新阶段。应用RT-PCR检测DEN国内外均有报道,有的学者应用一对通用引物来扩增,可以同时检测DEN 4个型的病毒,然后应用内引物鉴别4个型,或者应用核酸杂交和酶切分析的方法来进一步鉴定。有的学者合成了型特异的引物,每一对引物检测一个型别。Laille等应用RT-RCR的方法证明了6例患者同时感染DEN1型和3型,且用特异性探针杂交法进一步证实这6例患者确为双重感染。Lanci-otti等设计了一对通用引物,可以同时扩增4个型的DEN,最后用型特异探针杂交或用型特异引物做套式PCR,可以鉴别4个型的DEN。
    原位杂交技术已被作为诊断病毒性疾病及其发病机制研究的一个重要手段,它是将分子杂交与组织化学相结合的一项技术。Killen等报道应用原位杂交技术检测了不同血清型DEN RNA;临床上,应用该方法从DHF患者的白细胞涂片以及DSS死者胸腺切片中检出DEN RNA。同时比较了长、短两种基因探针的敏感性,结果表明:长探针(260 bp)杂交实验敏感性更高,能够测出更多的受染细胞。

Dv-RNA的检测
    近年来随着Dv基因组克隆和序列分析成功及核酸杂交PCR技术的建立,使Dv感染的诊断达到对病毒RNA检测的分子生物学新阶段。
    1.核酸杂交技术 1987年Henchal等用缺口平移法制备成32P探针,做槽斑点(dot-blot)核酸杂交,能检出最低Dv-RNA量为1pg,该法比抗原捕获ELISA、McAb-IFA敏感64倍。32P探针虽特异、敏感,但半衰期短,放射性污染不易处理,显影时间长等缺点,限制其推广使用,故目前各种非放射性标记探针已相继用于检测Dv-RNA。1987年Khan等应用光敏生物素(photobiotin)标记的Dv-Ⅱ-cDNA探针与Dv-Ⅱ感染的Vero细胞中的病毒RNA杂交,用亲和素-碱性磷酸酶系统检测,灵敏度达40pg。目前国内外常用的生物素(biotin,bio)标记的探针,灵敏度可达1~3pg,比上述光敏生物素标记探针敏感约40倍。其他用于Dv-RNA检测的非放射性标记探针,有用N-2-乙酰氨基芴(AAF)标记的免疫核糖核酸探针及辣根过氧化物酶(HRP)标记探针。前者用磷酸酶系统检测,后者用加强化学发光法(enhanced chemiluminescence,ECL)检测。上述四种非放射性探针均可检出pg级的靶核酸,虽不如32P标记探针敏感,但探针稳定,保存期长(6个月~2年),无放射性污染,使用安全出结果又快,ECL检测用的尼龙膜经处理后还可再次使用。但ECL,试剂昂贵,标本中(如血清)的发光底物可致假阳性,且需在暗室中检测;AAF是致癌物质,标记和操作时均需谨慎;生物素探针在NC上的非特异性背景高,影响试验结果的判断。1991年王树声等应用非放射性核素标记物异羟基洋地黄毒苷配基(digozigenin,Dig)通过随机引物法(random hexanucleotide primer,RHP)制成Dig-cDNA探针,用斑点杂交检测感染C6/36细胞的Dv-RNA和临床血清标本中的Dv-RNA,结果表明,此探针可测出提纯过的Dv-RNA的最低含量为0.1pg,可测叫出桂86~5、桂87~1登革热患者血清中Dv-RNA提取液的最高稀释度分别为1/320和1/160~1/320,其敏感性比用缺口平移法标记的Bio-探针高出近100倍,比Henchal等报道用32P标记的eD-NA探针高10倍,并具有型和种特异性,此外还具有非特异性背景染色低、快速、方法简便、重复性好、安全价廉等优点。Dig随机引物法标记核酸探针有望成为检测临床标本Dv-RNA和流行病学调查的常规快速诊断技术。
    核酸杂交法需依赖于病毒的分离培养,从各家报道看,从标本采集到出结果一般需3d,所以仅具有限的早期诊断意义。

2.PCR技术 1990年Deubel首次将PCR技术应用Dv-RNA的检测,经过几年的发展,该技术已日臻完善。
    ①引物的选择:Deubel等采用4对Dv型特异引物的混合的直接扩增标本中的Dv-RNA,然后用型特异的cDNA探针与扩增产物行dot-blot杂交,从而鉴定其血清型。上述方法需设计合成4对引物始可扩增出4个型别的Dv,为此,很多学者采用通用引物(universal primers or consensus primers)的策略。最早于1991年由Henchal等构建了一对通用引物,这样仅用单对引物通过RT-PCR就能直接从血清中扩增所有型的Dv-RNA,扩增产物分别与型特异探针杂交或型特异引物混合物行套式-PCR(nested-PCR)以鉴定型别。目前用过的通用引物有源自E区、NS3区、NS1区和3′-NC区者,敏感性和特异性均有确认的。总之,选用通用引物既方便又经济,值得推广。
    ②靶序列的检测:扩增产物的分型鉴定目前主要有三种方法。大多数学者采用核酸杂交和套式PCR,刘先洲采用Hae Ⅲ酶切,行RFLP法。上述三法均有高度特异性和敏感性,其中套式PCR最为敏感,可达1pg,相比之下,RFLP法进行分型要更经济、简便且省时,适于临床应用。
    ③操作程序的简化:经典的RT-PCR检测Dv-RNA需3个步骤:RNA的提取、反转录和PCR,至少需两个反应管,操作烦琐费时,一般需2d左右才能出结果。1991年秦鄂德等建立了一种抗体结合病毒的PCR方法,其特点是联合运用了抗原-抗体结合的高度特异性与PCR法的高度敏感性.病毒与其特异抗体的结合病毒RNA的释放及其cDNA的合成与扩增均在同一管中进行,扩增产物经1.5%琼脂糖电泳可清晰地看到一个单一的约539bp的条带。该法使检测更加特异、敏感和简便:易行,利用这种方法可检出2~2.5TCID50的Dv-RNA。1993年Chunguce等建立了二氧化硅-RT-PCR(silica-RT-PCR),利用二氧化硅能吸附、浓集RNA的特性,使RNA的提取、RT和PCR三步均在同—管中进行。只需1μl血清标本,5h内即可出结果。而且二氧化硅的使用,可免除生物标本中抑制物的影响。提高了敏感性,敏感性至少可达100TCID50、其他单管法可见文献。总之,用单管可明显缩短反应时间,减少了污染机会,简化了操作,适于临床应用。
    PCR是目前最敏感的Dv感染诊断技术,且能直接从患者血液中检出Dv-RNA,可做到早期确诊,但它只能在病毒血症期才能出现阳性结果。在标本的采集、运送和处理过程中导致核酸降解者也不能出现阴性结果。
    总之,应用分子生物学技术检测DEN基因为该类疾病的早期快速诊断和监测流行提供了先进可靠的方法,对DEN做进一步的分子病毒学研究具有重要意义。

     鉴别诊断

登革热的临床表观轻重不一,在非新疫区和流行区尤易误诊,应注意与流行性感冒、伤寒、麻疹、猩红热、药疹相鉴别;登革出血热的登革休克综合征应与黄疸出血型的钩端螺旋体病、流行性出血热、斑疹伤寒、败血症、流行性脑脊髓膜炎、黄热病等相鉴别。有脑损害的患者应与病毒性脑炎鉴别。

    【治疗概述】

本病尚无特效治疗方法。治疗中应注意以下几点:
    1.一般治疗 急性期应卧床休息,给予流质或半流质饮食,在有防蚊设备的病室中隔离到完全退热为止,不易过早下地活动,防止病情加重。保持皮肤和口腔清洁。
    2.对症治疗
    (1)高热应以物理降温为主。对出血症状明显的患者,应避免酒精擦浴。解热镇痛药对本病退热不理想,且可诱发G-6PD缺乏的患者发生溶血,应谨慎使用。对中毒症状严重的患者,可短期使用小剂量肾上腺皮质激素,如口服泼尼松5mg,3/d。
    (2)维持水电解质平衡。对于大汗或腹泻者应鼓励患者口服补液,对频繁呕吐、不能进食或有脱水、血容量不足的患者,应及时静脉输液,但应高度警惕输液反应致使病情加重,及导致脑膜脑炎型病例发生。
    (3)有出血倾向者可选用卡巴克洛(安络血)、止血敏、维生素C及K等止血药物。严重出血病例,考虑发病机制以变态反应为主,可应用较大剂量的肾上腺皮质激素,并及时使用止血药物如卡巴克洛、酚磺乙胺(止血敏),口服云南白药、静滴维生素Kl等,尚需输入新鲜血液或血小板,严重上消化道出血者可口服甲氰咪胍;对严重的胃肠道出血不止可试用胃管输入冰冻盐水,也可应用去甲肾上腺素口服治疗。
    (4)休克病例应快速输液以扩充血容量,并加用血浆和代血浆,合并DIC的患者,不宜输全血,避免血液浓缩。可先快速滴注50%碳酸氢钠、林格乳酸钠溶液,生理盐水或50%葡萄糖生理盐水,然后加用右旋糖酐或血浆,吸氧及纠正酸中毒,可使用地塞米松、氢化可的松、酚妥拉明或冬眠疗法。
    (5)脑型病例应及时选用20%甘露醇250~500ml,快速静注,同时静滴地塞米松,以降低颅内压,防止脑疝发生。

    【预防】

应做好疫情监测,以便及时采取措施控制扩散。患者发病最初5d应防止其受蚊类叮咬,以免传播。典型患者只占传染源的小部分,所以单纯隔离患者不足以制止流行。
    预防措施的重点在于防蚊和灭蚊。应动员群众实行翻盆倒罐,填堵竹、树洞。对饮用水缸要加盖防蚊,勤换水,并在缸内放养食蚊鱼。室内成蚊可用敌敌畏喷洒消灭,室外成蚊可用50%马拉硫磷、杀螟松等做超低容量喷雾,或在重点区域进行广泛的药物喷洒。
    登革热的预防主要是防止传染源的传入、传播媒介的控制和疫苗的接种。目前主要是依靠蚊媒控制的办法来预防和控制登革热的传播。但是真正控制登革热流行的关键在于疫苗的研制成功。
    国外学者研究得较早的是减毒活疫苗、DEN1~4型混合的减毒活疫苗在志愿者体内试用,已获得较好的免疫效果。但减毒株的稳定性差,如果减毒不充分的话,有可能引起临床症状,且可能发生因ADE而导致的登革热和DSS的潜在危险。因此近年来,人们注意亚单位疫苗的研究。Zhao等将DEN4型的结构蛋白及非结构蛋白NS1插入痘苗病毒载体成功地表达了PreM-E-NS1融合蛋白,并对动物有较好的免疫保护作用。一般认为,ADE与病毒的结构蛋白有关,因此非结构蛋白NS1产生疫苗可能不会诱导ADE。Schlesinger等从感染细胞中纯化DEN2型的NS1接种小鼠后,可保护小鼠免受脑内病毒攻击,接种猴子后,再用致死剂量的病毒攻击,有4/5可获得保护。Zhang等利用重组杆状病毒表达了DEN4型的NS1基因,用其免疫小鼠后,可抵抗同型病毒的致死性脑内攻击。
    近年来,国外学者对建立DEN全基因感染cDNA克隆和嵌合病毒疫苗作了报道,DEN4型感染性全基因cDNA克隆己构建成功,并用DEN1型或DEN2型的结构蛋白取代DEN4型cDNA克隆的结构蛋白而产生两型内嵌合病毒。两个子代嵌合病毒显示出DEN1型或DEN2型的血清型特异性。DEN1/DEN4嵌合疫苗接种恒河猴实验表明,有3/4的猴产生了针对DEN1型的中和抗体,并能够抵抗DEN1型的攻击,DEN2/DEN4嵌合疫苗接种4只猴子,全部产生了中和抗体,并能够抵抗DEN2的攻击。研究结果提示:这种嵌合病毒疫苗将有可能研制成为人类DEN的减毒活疫苗。
    核酸疫苗技术是近年来兴起的第三代疫苗技术,它为亚单位疫苗的研究提供了一条新的途径,它既有重组亚单位疫苗的安全性,又有减毒活疫苗诱导免疫应答的高效力。因此已有学者开始将它引入DEN疫苗的研究之中。相信不久将来,在DEN疫苗的研究中会有新的突破。
    综上所述,近年来全世界每年约有2.5亿人受到登革热的威胁。由于城市化扩大,人口的快速增长,垃圾处理不当,国际旅游增多,使DEN感染具有扩大的趋势,发病率不断增高。因此国内外学者对DEN的研究非常重视,但目前,登革热的发病机制,特效治疗以及疫苗等问题尚未从根本解决,其流行规律、宿主动物等尚不清楚,还有待进一步的探索研究。


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