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    临床病毒学检测标本采集、保存、运输方法

    【概述】

临床检测标本包括:体液、血液、分泌物、排泄物及组织等。能否发现一未知病原,在很大程度上取决于是否能正确、及时收集标本。标本采集、运输和保存的各环节都至关重要,对于检测结果的准确性及有效性影响极大。在常规检测中这些样本可能产生病毒颗粒气溶胶而造成交叉感染,为了防止检验人员的交叉感染,医学实验室安全管理及标本的采集、运送、检测和处理的安全性是十分重要的环节。

一、标本的容器
    运输容器、消毒标本容器、运输媒体、特殊测试的采集和运输的整套工具要严格要求。只有用合适的容器采集和运输的标本才能用于测试。标本容器必须认真加固以防泄漏。超过保质期的容器也不能用于采集和运输。
    必须在洁净的环境中培养。放在适当倾斜的琼脂或运输媒体上。用旋紧的试管,不要侧旋。病毒分离接种标本必须冷藏。不能使用琼脂培养基和混合培养。把倾斜管或病毒放在能密封的塑料袋中。按要求来放置和运输以上物品。根据原始容器的尺寸来选择传染性标本运输容器。

二、贴标签
    未经合适标明的传染性疾病标本不能用于检测。标本必须写上病人的名字和一个惟一的识别号码。如果使用独立的分类标签,标签要贴紧以防在运输过程中遗失。在贴标签的过程中不能影响标本的染色。每个切片都要贴上标签(仅在放切片的容器上贴标签是不行的),并且必须贴在接种标本切片的同一侧面。

三、检测申请单
    传染病标本必须具有一个测试申请单或电子申请单。必须注明标本的来源。对于标本的处理来说患者的资料,采集的时间和地点,临床病史,症状和诊断,抗生素的疗程,和任何可能的微生物记录。如果一种微生物送去鉴定,可能含有的其他微生物也必须指出。

四、运输
    运输的时候单纯追求速度是不对的。迅速处理使病原体的生活能力的损失降到最低,并保证菌丛有足够的数量用于精确鉴定。

五、检验报告
    一旦得到精确数据就可得到初步结果。最终结果一般在培养完成的时候得到。如果需要的话,只要一出现任何阳性,显著的染色或培养(如:血液,CSF,无菌的体液)就可把初步结果告知医生或实验室。电话通知的请求必须写在检测申请单或写在电子申请单的注脚上。必须有患者或实验室的名字以及电话号码。结果或关于结果的说明可以在工作时间从实验室获得。
    有报告价值的疾病、潜在的可能的疾病注明在最终报告上,判断报告的可信度及正确性则是具体操作的实验室和主治医生的责任。

六、临床标本采集的基本原则
    供分离病毒、检出核酸及抗原的标本,要求做到:
    1.早 特别是对用于病毒分离、抗原或核酸检测的标本。
    2.快 病毒离活体后在室温下很易死亡,故采得标本应尽快送检。不能及时检测的标本应放放装有冰块或干冰的容器内送检。短时间可低温保存,冻存的标本忌反复冻融。
    3.近 用于病毒分离、抗原或核酸检测的标本应尽量取自病变部位或接近病变部位(如脑炎取脑脊液,腹泻取粪便,呼吸道感染取鼻咽分泌物或支气管灌洗液,有病毒血症时采取血液)。
    4.多 标本的量不能太少,如有可能一次取多种标本,在病程急性期和恢复期都取标本。
    5.净 避免污染标本,特别是用于病毒分离或PCR检测的标本。

七、传染病标本采集的具体方法
    采集合适的标本进行培养是探索传染病的致病微生物的关键步骤。一次失败的标本采集可能会导致致病微生物分离的失败,并会增加一系列对受污染的微生物的处理。
    标本采集的基本概念:
    1.在合适的位置进行采集,避免受附近的组织或分泌物的污染。
    2.在最佳时间采集,血液标本应采集急性期和恢复期双份血清测定抗体滴度。
    3.采集的量要充分。
    4.使用合适的采集工具。消毒的、防漏的标本容器。使用合适的运输媒体(M4用于病毒和Chlamydia培养)。
    5.只要有可能就要在使用抗生素和抗病毒药物之前采集标本。
    6.恰当标记标本并填写检测申请单。写明标本来源。
    7.尽量缩短运输时间。在采集标本到送到实验室这段时间内要维持一个合适的环境。
    8.用70%~95%的乙醇和1%~2%的碘酒清洁皮肤表面。消毒作用能维持的最大时间为2min。
    以下是标本采集的具体说明:

【血液】 (病毒或分子测试)
    1.清洁皮肤表面用于血液培养。
    2.在5ml的EDTA真空采血管(lavender top)中采集血液。只有在必须的时候才使用儿科型号的试管(大约3ml)。不要用儿科试管采集成人和大于2岁的儿童的标本。
    3.采集后把试管翻转几次。
    4.采集后除去皮肤表面的碘酒。
    5.此时进行血沉的准备。
    6.直接运输全血标本。不要冷藏或试图从全血标本中提取血沉棕黄层。

【体液】 无菌(除尿液,脑脊液)。
    1.皮肤表面处理。
    2.使用消毒的针头和注射器采集液体。
    3.取10ml用于分析。剩余标本在封口的注射器中运输。
    ①如果有氧菌和无氧菌并存,则使用无氧运输的瓶子,保证厌氧微生物的存活。
    ②10ml腹膜液可放在血液培养瓶中。腹膜液是惟一可以放在血液培养瓶中的体液。
    ③需病毒分离则把3ml或更少的体液放在病毒运输媒体或无菌瓶中。
    ④病毒标本在2~8℃下直接送检。

【骨髓】
    1.医生在采集的时候必须穿手术衣,戴面罩,戴手套。
    2.皮肤表面处理。
    3.用无菌纱布皱起周围的皮肤。
    4.用无菌针头和注射器经皮抽取骨髓。
    5.在含有SPS的无菌管中放3~5ml标本。病毒培养和分子测试需要EDTA。
    6.在一般环境下运输标本。

【水疱,疱疹】
    1.清洁皮肤表面用于血液培养。
    2.用无菌的针头和注射器吸取液体和(或)脓液。
    3.取样后,置于合适的病毒或细菌运输媒介中。
    4.如果没有液体,则打开水疱或疱疹,用棉球擦伤口来采集细胞。

【脑脊液】
    1.采集标本时医生必须穿手术衣,戴面罩、手套。因为要使用一个开口的试管,其他人必须戴面罩或远离,避免呼吸污染。
    2.在皮肤上自中间向周围擦1%~2%碘酒,然后擦70%~90%乙醇溶液。
    3.在穿刺的部位用无菌的纱布使皮肤皱起来。
    4.插入针头。把标本注入3支无菌的防漏的试管中。按以下要求采集适当体积:
    ①细菌培养>1ml。
    ②真菌培养8~10ml。
    ③分子测试>1ml。
    ④分枝杆菌培养8~10ml。
    ⑤病毒培养>2ml。
    5.将试管严密封口。为了减少培养皮肤表面菌丛的可能,使用了第3支试管。
    ①将标本冷冻用于分子测试。
    ②病毒培养时,如果体积大于3ml则马上冷藏和运输。如果体积小于3ml,则用M4病毒运输媒介在2~8℃下运输。

【宫颈】 (宫颈内)细胞的培养。
    1.患者按截石术的位置放好。
    2.准备内镜的时候尽量用温水不用润滑剂。
    3.插入内镜并显示宫颈口。
    4.用棉球除去多余的黏液。
    5.将一个达可纶棉球伸入宫颈口,轻轻地旋转,保持10~30s。
    6.拿出棉球放在运输媒介中。
    7.在室温下运输,病毒培养则在2~8℃下运输。

【宫颈】 (宫颈内)细胞的HPV检测。
    1.使用一个ARUP公司产的Digene阴道取样管。这套工具包括一个阴道刷和一个用于HPV检测的试管。
    2.孕妇不要使用阴道刷。
    3.在获得DNA测试标本以前先采集Pap点状标本。在阴道镜用乙酸和碘酒处理以前先采集DNA标本。
    4.用棉球或达可纶球除去宫颈口内外多余的黏液。丢弃棉球。
    5.把阴道刷插入宫颈内口1~1.5cm直至阴道刷庞大部分的刚毛接触到宫颈外口。沿顺时针方向旋转3周。不要把阴道刷全部插入宫颈。
    6.取出刷子。不要使刚毛接触试管外壁或其他物体。
    7.把刷子插入试管底部。在画线处折断,把试管旋紧。
    8.在2~8℃下运输。
    9.宫颈活检:新鲜的宫颈组织纵长大于5mm的话必须直接放在Digene标本运输媒介中并冷冻。
    10.液基标本也可采集和运输。

【阴道分泌物】 阴道分泌物培养常常不能产生有意义的结果。在所有阴道分泌物可用核酸检测试验进行检测。可参阅宫颈取样。

【子宫内膜】
    1.使患者位于截石术的位置。
    2.插入内镜显示宫颈口。
    3.把一个窄内径的导管放在子宫口。
    4.通过导管插入一个棉签采集子宫内膜标本。这种方法避免了接触子宫黏膜,减少了感染的可能。
    5.把棉签放在运输媒介中,用于病毒培养则在2~8℃下运输。

【皮肤】
    1.用70%~95%乙醇溶液清洁皮肤。
    2.在活动伤口的边缘用解剖刀采集表皮碎屑。
    3.把标本放在一个干的无菌容器中。
    4.在室温下送检。

【耳】
    1.外耳的培养和处理轻微外伤的方法一样。
    2.中耳液的采集和采集无菌体液一样。如果诊断为中耳疾病,则从硬化鼓膜处取中耳液。

【眼】
    1.用温和的消毒剂清洁眼周皮肤。
    2.化脓性结膜炎:①用棉签采集脓液;②把棉签放在运输媒介中在室温下送检或在2~8℃下进行病毒培养。
    3.角膜感染 ①用上述方法擦拭结膜;②采集多样的角膜碎屑直接放在病毒运输媒介中;③室温下运输或在2~8℃下用于病毒培养。
    4.眼内液体:①用外科针头吸取液体;②用于细菌培养在室温下运输,病毒培养在2~8℃下,分子测试则需冷冻。

【鼻咽吸出物和(或)冲洗液】
    1.对吸出液来说,将黏液trap系在抽吸泵和导管上,将包装材料留在抽吸管上。打开抽吸管调整到指示的压力。
    2.如果没有专用抽吸泵,将导管插入鼻腔中,向后上方延伸打开外耳道。注意:达到后咽所插入的深度等于从前鼻孔到外耳道的距离。
    3.应用抽吸泵。旋转式移动,慢慢地退出导管。
    4.病毒培养在2~8℃转运或分子实验要冷冻。
    5.对于冲洗液来说,抽吸3~5ml消毒生理盐水放到一个新的生理盐水中。
    6.将球形管插入一侧鼻孔知道鼻孔被阻塞。
    7.挤压球形管向一侧鼻孔慢慢地灌输生理盐水,迅速松开球茎收集可回收的鼻腔标本。
    8.将球形瓶中的液体倒空到一个合适的干燥消过毒的标本容器中,或加3ml或加更少瓶中液体到病毒转运载体中(M4)。
    9.在2~8℃转运。

【鼻咽擦拭】
    1.患者取合适坐位,将头向后扬起。
    2.插入扩鼻器。
    3.从扩鼻器中插入一个棉签(用一根和伸缩的金属丝)到鼻咽部。
    4.缓慢旋转棉签停留20~30s。
    5.移出棉签,放入一个不生长的转运基中(例如原始擦拭标本移出的培养基)。将擦拭标本放入M4载体中用来做病毒培养。
    6.在室温下或2~8℃转运做病毒培养。
    (1)注意:因为棉签尖端很细而且容易干燥所以要用转运载体。可能出现的微生物有很复杂的营养要求。对于儿童来说,可以用特制的球形抽吸泵操作。
    (2)注释:①用一个常规棉签收集前鼻孔的培养标本。对于儿童,用一个鼻咽棉签方便收集标本;②室温下转运。

【咽喉】
    1.用一个棉的,涤纶的或藻酸钙的药签。
    2.用一个压舌板和一个明亮的光源,以保证有一个清晰的视野。
    3.到达腭垂之后并擦拭:①扁桃体;②后咽;③溃疡处,分泌物,伤口或发炎部位。
    4.将药签放入转移媒介中并在常温下转移或在2~8℃下做病毒培养。

【前列腺】
    1.用肥皂和水清洗阴茎头部。
    2.通过直肠按摩获取前列腺液。
    3.用一个消毒棉签采集液体。
    4.在室温下转运。
    5.作为选择,在信息之前或之后立即获取尿标本用来培养。

【唾液】
    l.确保患者合作采集充分的标本。ARUP将决定充足标本所需的鳞状上皮数目。
    2.按以下几点指示患者:①用流水漱口以去除食物残渣;②让患者深呼吸然后多咳几次以采集深部标本;③患者将痰液吐到干燥、消毒的容器中。
    3.如果患者无痰,用生理盐水喷雾诱导产生。考虑辅助呼吸治疗。
    4.迅速在室温下转运标本。如果预计会延迟1h转运则冷藏标本;要是做分子实验则冷冻标本。

【痰液】
    1.确保患者合作以采集到合适的标本。ARUP公司确定鳞状上皮细胞是合适的标本。
    2.给患者指示如下:①漱口去除食物残渣;②使患者深呼吸并咳嗽数次以得到深层标本;③患者必须把痰咳在干燥无菌的容器中。
    3.如果患者不能自行咳出痰液,则用喷雾的方法诱导。参考呼吸辅助治疗。
    4.在室温下直接送检。如果可能延误1h以上,则冷藏。如用于分子测试则需冷冻。

【大便】
    1.将采集的标本放在一个干净的有底浅盒子里或放在马桶座和便池之间的塑料包里。不要使尿液或洗手间的水污染大便。
    2.将标本放在一个干净的、干燥的容器里或放在适当的防腐剂中。
    3.常温下在2h之内将标本转移,或2~8℃进行试管培养。
    注:如果大便标本无法获得,以下是做培养时合适的替代方法:①擦拭直肠中的黏液物;②将直肠擦拭药签插入肛门里2.54cm(1英寸)(如果做轮状病毒/腺病毒EIA时不能用该法)。

【组织】
    1.组织的采集是一个不具有伤害性的操作并且需要一个训练有素的内科医生做手术采集。
    2.在无菌条件下采集组织。采集的组织包括损伤部位的中央和边缘部位。
    3.将标本放在一个无菌的容器里,容器应放在用消毒的无菌盐水浸泡的无菌纱布上。
    4.立即在常温下将标本转移,转移时要保证厌氧微生物的恢复。如果做病毒学培养,则不要使组织干燥,使组织在2~8℃的病毒转移介质(M4)中悬浮,做分子检测时要冷冻转移。
    5.不要将组织放在甲醛溶液里。

【尿液】
    1.女性患者采集尿液说明 ①移去内衣;②用肥皂和水洗手,冲手,然后用一次性纸巾擦干双手或者甩去多余水分;③用一只手将阴唇展开使之连续保持分开状态;④另一只手拿着开口的消毒杯,注意手不要接触杯子或杯盖的边缘及内面;⑤收集不同时段尿液(前段、中段、后段),接尿时不要中途停止。杯子不要接触腿、外阴或衣服;⑥将盖子盖住杯子。
    2.男性患者采集尿液的说明 ①洗手;②完全收回阴茎前部的皮肤;③收集不同时段尿液(前段、中段、后段),接尿时不要中途停止。杯子不要接触阴茎;④将盖子盖住杯子。
    3.核酸扩增试验第一段小便的采集 ①患者在前2h里必排过尿;②用一个干净的空塑料杯采集前20~25ml的尿液;③将盖子盖住杯子;④将放在特殊检测转移中介里的冷藏尿液转移。
    4.耻骨上吸取尿液 ①这并非是常规方式,最好由有经验的人操作。方法的操作可在相关文献中找到;②这些标本可做厌氧菌培养,如果需要做厌氧菌培养时,需要在厌氧环境中送检。
    5.留置尿管取尿 ①不要从导尿包中取尿,因为导尿管外部的细菌可能在该部位生长;②用乙醇垫擦干净导尿管;③用一个消毒针和注射器在管上打一个孔。直接从管中抽取尿液;④将尿液转移到一个消毒标本容器中;⑤不要用导尿管头培养。
    6.标本处理 立即在标本上做标签,并在采集后10min内冷藏于2~8℃环境里。

【伤口】
    1.伤口,可参阅大水疱,液疱。
    2.对开放伤口:①清洁伤口表面的开放窦管尽量去除表面的微生物菌丛,不要用杀菌药物;②尽量培养伤口底部和边缘以避免采集的是正常菌丛微生物;③以下是窦管首选的标本;a.用针或导管插入术获得的吸入物质;b.沿窦管线刮下的物质。④只有以上方法不可行时,才可采用从窦管上擦洗下的标本。窦管的擦洗可能不能准确反映潜在的疾病;⑤不要送检表浅伤口的细菌培养做厌氧菌培养。

八、病毒转移媒介(M4)
    一些标本送检时不需用转移媒介,因为可期望这些病毒有一定的繁殖能力。这一类的标本包括无菌的体液,如脑脊髓液、胸水、送检的置于EDTA的血液、尿液以及其他一些非无菌的标本,如鼻咽洗液,痰液,肺泡灌洗液和大便。只要对其稳定性有疑问时,标本就应放置于合适的转移中介里,如Microtest M4。
    1.组织和活检组织可直接放在病毒转移中介里。这些组织的直径不要大于1~2cm。
    2.脓肿组织,大水疱,脓疱,液疱,伤口和皮肤被刮削下的碎屑能用药签采集,直接放在病毒转移中介里。如果这些组织已经吸取,则放不超过3ml(等于转移中介量)的组织于M4。
    3.脑脊液可放在一个消毒容器里送检或加入M4管,但不超过3ml。
    4.尿液可放在一个消毒容器里送检或加入M4管,但不超过3ml。
    5.肺泡灌洗液,鼻咽洗液,痰液和别的一些无菌体液可放在一个消毒容器里送检或加入M4管,但不超过3ml。
    6.大便可放在一个消毒容器里送检或放在M4管里,标本如一个胡桃大小。
    7.血液可放在一个EATA管里送检。不要吸取血层棕黄层。
    病毒转移中介(M4)的规格与其他液体病毒转移中介(如从Bartels,Syva等获得的标有Viral/Chlamydia转移物的转移中介)一样。用藻酸钙和木材制作的擦拭药签可以对一些病毒的恢复有干扰。这些也可能是PCR抑制物,因此不适于用在这类检测中。可用灭菌的塑料柄的聚酯纤维人造丝织物拭子。

九、标本保存
    1.取样后的标本,越早检验,分离病原体的效果越好。镜检应在采样当时制片(干燥、固定和染色)。做细菌分离培养的样本密封后常温下2h内送检。不能及时检验或检验周期较长的标本应低温保存,并及时送检。
    2.供一般检验的样品,在8℃以下保存,使用结实密封加冰的广口保温瓶装运即可。
    3.供分离病毒的样品,在标本采集后尽快接种,否则应立即-70℃冷冻保存,温度越低保存时间越长,可用化学制冷剂或置液氮瓶中保存。常用的样品运输液为:pH7.4~7.6的Hank’s,Eagle’S或水解乳蛋白液。或使用厂家提供的病毒转移媒介。为防止细菌和真菌生长,在采样液中需加入青霉素、链霉素,终浓度为每毫升1 000U青霉素和100μg的链霉素,(也可用庆大霉素,其终浓度为每毫升1mg,)同时加制霉菌素,终浓度为每毫升4μg。分离病毒的组织可放于50%甘油磷酸盐缓冲液中,在5℃条件下保存数周。用于组织或细胞内病毒抗原检测的标本应固定后再冷藏保存。污染标本,如鼻咽分泌液、粪便等应加入青霉素、链霉素或庆大霉素等,以免杂菌污染细胞或鸡胚,而影响病毒分离。
    4.无条件开展监测的单位,应在冷藏条件下24h内将标本送到相关实验室,否则冷冻保存,l周内送检。

(一)包装
    1.标本应放在已灭菌的带螺旋盖(有密封垫圈)的塑料管(A)中。
    2.直接在标本管(A)上用油性记号笔写明样品种类、姓名、编号、采样时间。
    3.将密闭后的标本管放入大小适合的塑料袋(B)内密封,每袋装一份标本。
    4.将标本的有关信息填在“××病毒标本送检登记表”,连同标本管(B)一起密封在另一塑料袋(C)内。
    5.管和送检表的塑料袋(C)放入另一个密封、耐受一定压力容器(D)中,内填吸水和具缓冲能力的材料,外面印有生物危险标记。
    同一患者2份以上的密封标本,可以放在同一个塑料袋内再次做密封后放入容器(D)内。
    6.将装有标本管和送检表的容器(D)放入专用运输箱(E)内,放入冰排,并用柔软物质填充,关紧箱盖。
    7.液体的包装。主要容器应该是防漏的,且容量不得超过500ml。在主要容器和第二层内包装之间应放置能吸收液体的物质;如果几个易碎的主要容器放在同一个第二层包装内,它们要单独包裹或有隔离层,以防止它们互相碰撞。主要容器或第二层包装应经受内压产生的至少为95 kPa(0.95 bar)压差而不漏。外包装容量不得大于4L。
    8.固体的包装。主要容器应该是防散落的,且容量不得超过500g。如果几个易碎的主要容器放在同一个第二层包装内,它们要单独包裹或有隔离层,以防止它们互相碰撞,并且应有防漏的第二层包装。外包装容量不得大于4kg。空运完整包装的最小尺寸不得小于l0mm。

(二)运送
    1.送检的标本,要求严密包装,外表加以消毒。编号、登记后,贴上“生物危险标识”标签,严防漏脱和遗失。
    2.认真填写标本送检单,由专人、专车,尽快送到指定的检验部门或单位,完成交接,索要回执。
    3.妥善保存,运送途中要避免日光和高热,利用一切条件防止病原微生物死亡。
    4.标本至实验室后,病毒分离标本应尽快进行接种分离,48h内能进行接种的可置于4℃保存,如未能接种应置-70℃或以下保存。

(三)标本的接收
    1.各省级中心实验室应公布标本接收联系方式,并实行24h标本接收制。
    2.国家实验室标本接收需送国家指定中心实验室检测的原始标本、病毒分离物、可疑阳性标本、血清等,填写标本送检登记表,在低温保存条件下,于24h内送至指定中心进行复核。
    3.接收实验室应有接收标本记录,时间、接收人及完整的标本信息登记。并向送达人开具回执。


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审核人:吴娜      
最后修改人:吴娜      





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